„Was zeigt eine HPLC-Analyse bei Peptiden wirklich?"

Was zeigt eine HPLC-Analyse bei Peptiden wirklich?

Analytik | Chromatographie | 6 Min. Lesezeit

Ein Analysezertifikat mit dem Wert „≥99% Reinheit" wirkt eindeutig. Was dahintersteckt, ist es weniger. Dieser Artikel erklärt, was die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) tatsächlich misst – und wo ihre Grenzen liegen.

Das Funktionsprinzip

Bei der reversed-phase HPLC wird eine Probe durch eine mit stationärer Phase gefüllte Säule gepumpt. Peptidmoleküle interagieren unterschiedlich stark mit dieser Phase und werden dadurch zeitlich getrennt – nicht durch ein klassisches Gleichgewicht wie bei kleinen Molekülen, sondern durch einen Adsorptions-Desorptions-Mechanismus, der für Peptide charakteristisch ist¹. Am Ende der Säule registriert ein UV-Detektor die austretenden Fraktionen als Peaks.

Was ein "sauberer" Peak bedeutet – und was nicht

Ein einzelner, scharfer Hauptpeak zeigt an, dass der überwiegende Anteil der UV-aktiven Substanz zur gleichen Zeit eluiert. Der Reinheitswert wird üblicherweise durch Flächennormierung berechnet: Fläche des Hauptpeaks im Verhältnis zur Gesamtfläche aller detektierten Peaks.

Wichtig für die Einordnung: Diese Methode kann isomere Verunreinigungen – Moleküle mit identischer Masse, aber unterschiedlicher Struktur – nicht zuverlässig von der Zielsubstanz unterscheiden, wenn sie chromatographisch nicht ausreichend getrennt werden². Ein hoher HPLC-Reinheitswert ist daher ein starkes, aber kein absolutes Indiz für Identität.

Warum HPLC allein nicht genügt

Aus diesem Grund wird HPLC in der Regel mit Massenspektrometrie kombiniert (siehe unseren Artikel zu Rezeptoragonisten und Analytik im Detail). Während HPLC die Reinheit misst, bestätigt die Massenspektrometrie die Identität über das Molekulargewicht.

Fazit

Eine HPLC-Analyse ist ein etabliertes, aber kein unfehlbares Werkzeug. Ihre Aussagekraft hängt von der gewählten Methode, den verwendeten Referenzstandards und der Kombination mit ergänzenden Verfahren ab. Ein CoA, das nur einen Reinheitswert ohne Methodendetails ausweist, sagt weniger aus als eines, das Säule, Gradient und Detektionswellenlänge dokumentiert.

Quellen
¹ Nyakuchena F, et al. Development and Validation of a Reversed-phase HPLC Method for Assay of the Decapeptide Cetrorelix Acetate. (Diskussion des Adsorptions-Mechanismus bei Peptiden in RP-HPLC)
² D'Hondt M, et al. A strategy for assessing peak purity of pharmaceutical peptides in reversed-phase chromatography methods using two-dimensional liquid chromatography coupled to mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 2023.